探究ADAR1的功能與機制：ADAR1 熒光素酶報告基因HEK293 細胞系

BPS Bioscience最近發布了全新的ADAR1雙熒光素酶報告基因HEK293細胞系，可廣泛應用于各種針對ADAR1的研究領域。這一細胞系為研究提供了強大的工具，有助于深入探究ADAR1的功能與機制。

作用于 RNA 的腺苷脫氨酶(ADAR) 蛋白催化雙鏈 RNA (dsRNA) 分子上腺苷轉錄后修飾為肌苷 (A-to-I)。 ADARs 在延伸的雙鏈 RNA 雙鏈體中非選擇性地將 A 編輯為 I，這是一種起源古老且高度保守的活動。在人體中，ADAR1 和 ADAR2 具有脫氨活性，而 ADAR3 缺乏催化活性。 ADAR1 有兩種亞型，ADAR1p110 和 ADAR1p150。較大的 p150 亞型包含核輸出序列，使其能夠在細胞質和細胞核中表達，而 ADAR1p110 亞型和 ADAR2 缺乏該結構域，主要位于細胞核內。 ADAR1 作為主要的 RNA 編輯器其作用可導致RNA 其他結合蛋白對 RNA 加工的差異性調節（參考文獻1、2、3）。

A-to-I 編輯是一種影響編碼和非編碼 dsRNA 的轉錄后機制，由作用于 RNA (ADAR) 酶家族的腺苷脫氨酶催化。 內源性 dsRNA（主要來源于 Alu 重復元件）的 A-to-I 修飾阻止了它們被細胞 dsRNA 傳感器識別，從而避免了抗病毒信號的誘導和不受控制的 IFN-I 產生。 這個過程由 ADAR1 活性介導，確保激活針對外來（非自身）而非自身核酸的先天免疫反應。 因此，ADAR1 突變或其失調的活性會促進自身免疫性疾病的發展并強烈影響細胞生長，從而導致癌癥。 此外，Adar1 消融促進的過度炎癥也會影響 T 細胞和 B 細胞的成熟，以及樹突狀細胞亞群的發育，揭示 ADAR1 在免疫系統穩態中的新作用。

值得注意的是，ADAR1 可通過抑制模式識別受體機制來調節先天免疫。在病毒感染期間，長鏈外源 dsRNA 被 MDA5、PKR 和 OAS 識別，啟動三個途徑導致細胞凋亡以防止病毒傳播。 MDA5 途徑導致干擾素 (IFN) 基因的誘導表達，這對于對抗病毒感染至關重要。在沒有病毒感染的情況下，dsRNA 的內源序列會被 ADAR1 修飾，從而阻止它們被這些先天免疫傳感器識別。盡管在細胞區分外源或內源 dsRNA 中必不可少，但 ADAR1 對 RNA 的修飾可直接導致氨基酸取代，從而導致疾病。

最后，ADAR1 和 ADAR2 在蛋白質多樣性的轉錄后擴展中發揮重要作用，因為它們可以引入終止密碼子、可變剪接位點和內源性前體 mRNA 中的錯義突變。前體 mRNA 的 A-to-I 編輯，被翻譯機器讀取為 G，有時會產生不同的氨基酸，因此蛋白質的氨基酸序列與基因編碼序列不同。這些變化取決于前體 mRNA 中形成雙鏈的環的形成，編輯發生在外顯子中。其中一些不同的蛋白質在發育過程中發揮作用，并受編輯器的組織特異性和時間表達的調節。

在神經系統（神經遞質、離子通道、G 蛋白偶聯受體）中觀察到的其他變化擴展了蛋白質功能。一個眾所周知的例子是谷氨酸受體，其中通過 ADAR2 將 CAG 變為 CGG（谷氨酰胺 Q 變為精氨酸 R）導致鈣滲透性顯著增加。血清素受體 5-HT2C 在其信使 RNA 中包含 3 個潛在修飾位點。 AQ/R 站點是編輯程度最高的站點，高達 99% 的轉錄本被修改，導致影響食欲和情緒的細胞內信號發生變化。

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ADAR1在疾病中的作用

導致蛋白質功能受損的 ADAR1 特定基因突變與幾種 IFN 介導的疾病有關，包括 Aicardi-Goutieres 綜合征、遺傳性對稱性色素異常癥、雙側紋狀體壞死和痙攣性截癱。類風濕性關節炎 (RA) 和系統性紅斑狼瘡 (SLE) 等自身免疫性疾病也與 ADAR1 相關，在 RA 患者中觀察到 ADAR1p150 過表達，在 SLE 患者中觀察到高水平的 A-to-I 編輯。

重要的是，ADAR1 過度活躍或功能喪失都與各種癌癥以及癌癥的潛在治療方式有關。隨著檢查點阻斷免疫療法的出現，研究人員繼續尋找增強療效的機制，尤其是針對實體瘤的療效。 ADAR1 本身可以充當免疫檢查點?，F在的研究已經確定，使腫瘤細胞中的 ADAR1 失活會使它們對免疫療法高度敏感，這一過程與未經編輯的 dsRNA 和誘導 IFN 通路的模式識別受體的激活有關。

ADAR1 可以通過幾種不同的機制影響腫瘤發生。首先，特定轉錄本的 ADAR1 RNA 編輯與某些類型的癌癥及其致病性有關。特別是，AZIN1、DHFR、FAK、GLI1、MYC 和 RHOQ mRNA 的編輯與腫瘤發生增加或治療耐藥性增加有關。其次，編輯腫瘤抑制 miRNA，特別是 let-7 miRNA，導致它們的生物發生減少，從而促進慢性粒細胞白血病的自我更新。另一方面，ADAR1 對其他 miRNA 的活性發揮腫瘤抑制作用。例如，ADAR1 降低了 miR-378 和 miR-455 的水平，它們是腫瘤抑制因子的抑制劑。這種調節與限制黑色素瘤的進展和生長有關。最后，ADAR1 編輯可以限制癌癥中的選擇性剪接，正如 CCDC15 外顯子 9 所觀察到的那樣，這是一種致瘤性剪接變體，可因 ADAR1 的活性而降低。

用于篩選 ADAR1 抑制劑的新型熒光素酶報告細胞系

基于 K. Fritzell 等人描述的類似報告系統。?(4)?、BPS Bioscience發布了第一個商業化的基于熒光素酶的報告細胞系，用于篩選ADAR1的抑制劑。該細胞系在 CMV 啟動子的控制下表達 ADAR1，在單獨的 CMV 啟動子的控制下表達 ADAR 編輯 RNA 報告構建體。報告基因包含編碼螢火蟲熒光素酶的基因，該基因在細胞中組成型表達，位于編碼 GluA2 ADAR 底物的基因上游，隨后是海腎熒光素酶基因。對應于 GluA2 的序列已被修改為包含一個琥珀終止密碼子 (UAG)。當由 ADAR 編輯時，此終止密碼子 (UAG) 將更改為色氨酸代碼（UIG，其中 I 翻譯解釋為 G），從而導致海腎熒光素酶 (A) 的表達。相反，在沒有 ADAR1 活性的情況下，翻譯在終止密碼子處終止，海腎不表達。報告基因活性讀出為海腎熒光素酶/螢火蟲熒光素酶比率，從而在抑制 ADAR 活性 (B) 時讀取 UAG（終止）密碼子，導致海腎熒光素酶表達減少和海腎熒光素酶/螢火蟲表達減少熒光素酶比率。

該細胞系統可作為用于高通量化合物篩選以鑒定特定 ADAR1 抑制劑的出色解決方案。

ADAR1 Luciferase Reporter-HEK293 細胞對 Fludarabin-Cl 的劑量反應。用增加劑量的 Fludarabin-Cl 處理細胞 30 小時，并使用雙重熒光素酶（螢火蟲-海腎）測定系統測量螢火蟲和海腎熒光素酶活性。結果顯示為海腎/螢火蟲熒光素酶比率。

References

1. B. Song, et al. 2022. Wiley Interdiscip Rev RNA. 13(10):e1665.?Pubmed

2. L. Xu and M. Ohman. 2018. Genes (Basel). 10(1):12.?Pubmed

3. M. Lamers, et al. 2019. Front Immunol. 10:1763.?Pubmed

4. K. Fritzell, et al. 2019. Nucleic Acids Res. 47(4):e22.?Pubmed