彗星實驗(Comet assay)也被稱為單細胞凝膠電泳實驗(Single cell gel electrophoresis,SCGE),是一種在單細胞水平上檢測DNA損傷的技術。當各種內源性和外源性DNA損傷因子(氧化和環境壓力等)誘發細胞DNA鏈斷裂時,其超螺旋結構受到破壞,在細胞裂解液作用下,細胞膜、核膜等膜結構受到破壞,細胞內的蛋白質、RNA以及其他成分均擴散到電解液中,而核DNA由于分子量太大不能進入凝膠而留在原位。電泳過程中,如果DNA沒有損傷,則將停留在原位,染色后呈圓形的熒光團,無拖尾出現。如果DNA受損,斷裂的碎片進入到凝膠中,在電場的作用下,DNA碎片離開原位向陽極遷移,形成拖尾。DNA受損越嚴重,斷裂越多,產生的碎片就越多、越小,則向陽極遷移的DNA碎片量就越多,遷移距離也越長,熒光染色后就能看見“彗星”樣尾長并且熒光強度增強。
艾美捷科技作為專業的生命科學領域解決方案供應商,為您推薦Biogradetech品牌特色的彗星檢測試劑盒——彗星法DNA損傷分析試劑盒(貨號:D-AKE3040-15T)。產品僅限用于科研學術研究用途,不得用于醫療與診斷。
D-AKE3040-15T彗星檢測試劑盒內提供了彗星分析所需的所有必需試劑,包括裂解液(Lysis Solution)、彗星分析凝膠、熒光染料、彗星分析玻片等其它試劑。
彗星檢測試劑盒的介紹&原理:
該分析的原理是基于變性、斷裂的DNA片段在電場的影響下遷移出細胞的能力,而未受損的DNA遷移較慢并在施加電流時保持在類核范圍內。對DNA“彗星”尾部形狀和遷移模式的評估可以用來評估DNA損傷。在該測定中,細胞被固定在彗星玻片上的瓊脂糖床中。在溫和的細胞裂解后,用堿處理樣品以解開DNA并使DNA變性。然后將樣品進行電泳并用熒光DNA嵌入染料進行染色。然后通過熒光顯微鏡觀察樣品。對于那些沒有熒光顯微鏡的研究人員來說,銀染是一種選擇,它允許用標準的光顯微鏡進行數據分析。
電泳步驟可以使用TBE buffer或堿性電泳溶液進行。TBE避免了與使用無緩沖堿進行電泳相關的問題,例如由于鈉離子的電荷飽和而導致DNA遷移不良以及難以控制電壓。TBE是分析細胞凋亡的首選,并且可以使用尾長而不是尾矩進行數據分析。堿性電泳更靈敏,可以檢測到更少量的損傷。以非常低的電流運行時,電泳時間可延長至40分鐘。如果根據彗星尾部長度的大小對彗星進行評分,則可以對數據進行定性分析。使用計算尾長和尾矩的幾種商業可用的圖像分析軟件包之一分析結果,可以很容易地生成定量和統計數據。
Enzo的彗星SCGE實驗的彗星玻片經過特殊處理,以促進低熔點瓊脂糖的粘附。這消除了耗時和不可靠的傳統方法制備瓊脂糖基層膠。彗星玻片的使用縮短了分析時間,允許對大量樣品進行快速可靠的分析。
目前有兩種常見的彗星實驗檢測方式——堿性處理&中性處理。在堿性處理條件下,DNA發生變性,因而可檢測包括單鏈及雙鏈斷裂在內的所有DNA損傷;在中性處理條件下,DNA維持雙鏈構象,因而主要檢測雙鏈斷裂。
彗星檢測試劑盒的優勢:
(1)即用型彗星玻片無需預處理即可直接應用樣品;
(2)更短的測定時間允許更高通量的樣品分析;
(3)疏水屏障允許使用DNA修復酶處理樣品;
(4)與溴化乙錠相比,獨特的核酸染料可提高DNA可視化的靈敏度。
彗星檢測試劑盒的應用:
陰性對照:CaSki細胞未經處理。進行彗星SCGE檢測并使用FITC濾光片對玻片進行成像。 | |
陽性對照:CaSki細胞在 4°C下用100mM過氧化氫處理20分鐘。進行彗星SCGE檢測并使用FITC濾光片對玻片進行成像。 |
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來源:彗星檢測試劑盒(Comet SCGE assay kit)的原理和優勢
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