一、實驗原理?
IgG,作為免疫球蛋白家族的重要成員之一,在動物和人體血漿中起著至關重要的作用。血漿中的蛋白質成分繁多而復雜,因此要從血漿中分離出純凈的IgG,就需要經歷一系列復雜的步驟。首先,需要盡可能地去除其他蛋白質成分,以使IgG在樣品中的比例顯著提高。隨后,通過純化過程,可以獲得高純度的IgG樣品。這種純化過程對于研究和應用IgG都具有重要意義。
硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質。用此方法可以將主要的免疫球從樣品中分離,是免疫球蛋白分離的常用方法。高濃度的鹽離子在蛋白質溶液中可與蛋白質競爭水分子,從而破壞蛋白質表面的水化膜,降低其溶解度,使之從溶液中沉淀出來。各種蛋白質的溶解度不同,因而可利用不同濃度的鹽溶液來沉淀不同的蛋白質。這種方法稱之為鹽析。鹽濃度通常用飽和度來表示。
硫酸銨因其溶解度大,溫度系數小和不易使蛋白質變性而應用廣泛。DEAE-纖維素(Diethylaminoethyl-cellulose,DEAE)是在纖維素上引入二乙基氨基乙基,屬于弱堿型陰離子交換劑。吸附蛋白質的最適pH范圍為7~9,pH超過9.5,DEAE基團則不解離帶電荷。每克DEAE含0.96~1.24mmol/L可解離基團,與蛋白質的交換量可75-122mg/100mgDEAE。應用離子交換劑來純化物質,是把要純化的物質成分交換吸附于離子交換劑上,然后再分別洗脫下來獲得純品,或者把不需要的成分吸附于離子交換劑上,需要的成分直接流出,得到純品。
本實驗采用DEAE-纖維素層析柱純化血清IgG,利用pH6.7的緩沖液溶解樣品IgG,此時IgG粗物中除IgG外,其他雜蛋白均帶上不同數量的負電荷,可以和DEAE上的陰離子發生交換吸附于柱上。IgG因不解離帶電,而不發生交換吸附,利用此特點,讓溶解后的樣品流過DEAE纖維素柱,即可直接收集到較純的IgG。
二、實驗方法和步驟?
1.取20ml血清,加生理鹽水20ml,再逐滴加入(NH4)2SO4飽和溶液10ml,使成20%(NH4)2SO4溶液,邊加邊攪拌,充分混合后,靜置30min。
2.3000r/min離心20min,棄去沉淀,以除去纖維蛋白。
3.在上清液中再加(NH4)2SO4飽和溶液30ml,使成50%(NH4)2SO4溶液,充分混合,靜置30min。
4.3000r/min離心20min,棄上清。
5.于沉淀中加20 ml生理鹽水,使之溶解,再加(NH4)2SO4飽和溶液10 ml,使成33%(NH4)2SO4溶液,充分混合后,靜置30 min。
6.3000r/min離心20min,棄上清,以除去白蛋白。重復步驟5,2~3次。用10 ml生理鹽水溶解沉淀,裝入透析袋。
7.透析除鹽,在常水中透析過夜,再在生理鹽水中于4℃透析24 h,中間換液數次。
8.以1%BaCl2檢查透析液中的SO42-或以納氏試劑檢查NH4 (取3~4 ml透析液,加試劑1~2滴,出現磚紅色即認為有NH4 存在),直至無SO42-或NH4 出現為止。也可采用SephadexG25或電透析除鹽。
9.離心去沉淀(去除雜蛋白),上清液即為粗提IgG (即γ球蛋白,如以36%的飽和硫酸銨沉淀血清的產物即為優球蛋白,Euglobin,含γ球蛋白)。
10.過DEAE-纖維素層析柱。以0.01 mol/L pH7.4 PBS(0.03 mol/L NaCl)洗脫,收集洗脫液。也可采用SephadexG150或G200柱。
三、注意事項?
1.一般不選用去離子水作為透析液,因為當選用去離子水時,透析袋內外達到滲透平衡時,因透析袋內蛋白質濃度很高,集聚了大量的負電荷,會產生很大的滲透壓。通常選用低濃度的緩沖液作為滲透壓。
2.透析袋在出廠時,一般使用10%甘油處理過,因此可能含有極微量的重金屬,硫化物等對蛋白質有害的雜志。使用前可將透析袋建成10~20cm每段,在2%的碳酸氫鈉和1mmol/L的EDTA混合液中煮沸10min,并用蒸餾水徹底洗凈,存放于4℃,使用前需先灌滿水,指壓檢查不漏,方可裝樣,留有三分之一至一半的空間,以防透析袋漲破。
3.透析過程中每隔2小時換一次透析液,共操作3次后,第四次更換透析液,保持過夜,第二天早上即可得到純化樣品。