實驗室常用的動植物組織和細胞RNA提取方法包括傳統的含氯仿的RNA提取試劑和無氯仿RNA提取試劑。這兩種方法的基本原理是利用單相裂解試劑進行RNA提取。在這個過程中，生物樣品被異硫氰酸胍和苯酚的單相溶液裂解，然后加入氯仿（或溴氯丙烷），混勻后離心，使混合物分為水相和有機相。RNA主要存在于水相中，而DNA位于水相和有機相的分界處，變性蛋白則存在于有機相中。
分離后的水相可以通過異丙醇沉淀來回收RNA。如果需要提取DNA和蛋白質，可以使用順序沉淀分離方法：DNA可以通過乙醇沉淀從中間相中獲得，蛋白質則可以通過異丙醇沉淀從有機相中獲得。
回收的DNA片段大小約為20kb，適用于PCR模板。然而，由于暴露于胍鹽，蛋白質會變性，因此主要用于免疫印跡實驗。這些方法為實驗室提取RNA、DNA和蛋白質提供了可靠的手段，有助于進行分子生物學研究和實驗工作。
實驗操作實例
接下來我將以果蠅成蟲為例詳細介紹兩種方法的步驟
樣本處理：
A. 組織樣本
1.將新鮮組織用液氮速凍，迅速轉移至液氮預冷的研缽中，用研杵研磨，期間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀(無明顯可見顆粒)。
▲研磨不徹底會影響RNA的得率和質量。
2. 將研磨成粉的樣品轉移至離心管中，大約每50 mg組織加入1mL 含氯仿 （500μL 無氯仿試劑）， 渦旋振蕩至充分裂解，室溫靜置5 min。
▲每500μL 無氯仿試劑最多可裂解50 mg動物/植物組織，過多的樣本量可能會導致裂解不充分，并使產物純度降低。肝臟、脾臟、腎臟等組織DNA/RNA含量豐富，過多樣本量還會導致gDNA殘留或產量降低。
▲若沒有條件用液氮研磨，可將新鮮組織盡量剪碎浸泡在單相裂解試劑中，用電動勻漿器高速勻漿至組織塊徹底裂解（這里我使用手動研杵研碎，手動研磨時應注意避免局部積熱，盡量在冰上進行）。
3. (可選)11，200 rpm(12，000 x g)室溫離心5 min。小心吸取上清至新的1.5 ml離心管，切勿吸取沉淀。
▲若樣本含有較多蛋白質、脂肪、多糖或肌纖維、植物塊莖等，可離心去除不溶物質，離心得到的沉淀包括細胞外膜、多糖、高分子量DNA，RNA存在于上清中。提取脂肪含量較高的組織樣本時，若上層含有大量油脂，應去除。轉移上清進行后續操作。
B. 懸浮細胞樣本
1.離心收集細胞，棄盡上清，每1×105~1×107個細胞加入1mL 含氯仿 （500μL 無氯仿試劑）。
2.渦旋振蕩或用移液器反復吹打直至充分裂解，室溫靜置5 min。
▲對于凍存細胞，加入無氯仿試劑應立即進行振蕩，否則會導致裂解不充分。
C. 貼壁細胞樣本
1.棄去細胞培養液，用1×PBS清洗一次，棄盡廢液。
2.常規6孔板每孔或直徑3.5 cm平皿(約10 cm2培養面積)的細胞加入500μL 無氯仿試劑，每100mm平皿加入1mL 含氯仿，使之充分覆蓋到細胞表面，然后用移液器反復吹打細胞使其脫落。
▲對于貼壁牢固的細胞(細胞團)可采用細胞刮或者潔凈的槍頭剝離，或增加單相裂解試劑的用量，亦可在加入單相裂解試劑之前采用胰酶將細胞消化下來，然后按照懸浮細胞處理。
3.將裂解液轉移至1.5 ml離心管，渦旋振蕩或用移液器反復吹打直至充分裂解，室溫靜置5 min。
▲浸在含氯仿試劑中的樣本可以在-60~-80°C存放至少一個月
含氯仿法提取RNA
1. 孵育勻漿樣品，室溫5min，以完全裂解核蛋白復合物；
2. 每毫升含氯仿加入0.2mL氯仿；蓋緊管蓋用力搖動15s，并在室溫下孵育2-3min；
▲不要渦旋樣品，因為它會導致DNA污染。
▲注意使溶液充分混勻為均一溶液，混勻不徹底影響RNA提取效率和雜質去除效率。
3. 4°C，12000g 離心15min，混合物分為三相，RNA僅存于上層水相；
4. 小心地將上層水相轉移至新Ep管內，注意不要擾動中間層；
▲每1mL 含氯仿可獲得約600μL水相，為防止DNA污染推薦只回收500μL。
5. 每毫升含氯仿加入0.5mL異丙醇沉淀RNA，顛倒混勻，室溫孵育10min；
▲注意使溶液充分混勻為均一溶液，混勻不徹底將無法使RNA沉淀。
▲低濃度樣品中回收RNA時效率很低，可以在此步加入1μL糖原（20mg/mL）。
▲為防止溫度過高使RNA降解，也可以置于冰上、-20°C冰箱中進行沉淀。
6. 12000g離心10min，收集RNA沉淀；
7. 棄上清，并用吸頭完全去除殘留液體；
8. 用75%乙醇洗滌一次RNA沉淀，每毫升含氯仿加入至少1mL 75%乙醇，渦旋混合樣品液，然后在4°C 7500g離心5min；重復清洗一次；
▲沉淀于75%乙醇的RNA可儲存在2~8°C至少一周，-5~-80°C至少一年。
9. 完全去除乙醇，空氣干燥或真空干燥RNA沉淀10min；
▲除去乙醇后，沉淀應該是半透明的，在干燥時，沉淀將變成透明凝膠體狀。不要真空離心干燥的RNA。重要的是不要讓RNA沉淀完全干燥，因為這將大大降低其溶解度。
10. 用20~100μL的RNase free水溶解RNA，反復吹打幾次。
▲部分方案中建議在55-60°C溫育10min，這里我個人不建議進行加熱；若RNA過于干燥，可在40°C溫育直至其完全溶解。
無氯仿法提取RNA
1.向孵育勻漿樣品中加入Dilution Buffer。（動植物組織:每500μL 無氯仿試劑加入100μL Dilution Buffer；細胞:每500μL 無氯仿 Reagen加入150μL Dilution Buffer。）蓋緊離心管蓋，渦旋振蕩至溶液充分混勻，室溫靜置5 min。
▲振蕩時注意使溶液充分混勻為均一溶液，混勻不徹底影響RNA提取效率和雜質去除效率。
2. 12，000g室溫離心15 min。
3.小心取出離心管。此時樣本中蛋白質、DNA、多糖等雜質沉淀到管底，RNA分布在上層溶液中，小心吸取上清溶液(約500μL)至一個新的離心管中。
▲上層溶液的體積約占總體積的90%，用500μL 無氯仿試劑進行提取，上層溶液約為550μL ；吸到下層沉淀會導致基因組及雜質污染。
▲部分樣本上清輕微渾濁或有顏色，可繼續后續操作，不影響產量和純度。
▲組織投入量為50 mg時，吸取上清溶液體積建議減少至450μL ，防止吸到下層沉淀。
4.在得到的上清溶液中加入等體積異丙醇，上下顛倒充分混勻，室溫靜置10 min。
5. 12，000g室溫離心10 min，離心后在管側和管底可以看見白色凝膠狀沉淀，小心棄去上清，勿丟失沉淀。
▲RNA含量少會導致沉淀不明顯，小心棄去上清，勿丟失沉淀。
▲部分特殊樣本如:水稻葉RNA沉淀會分散在離心管壁上導致白色沉淀不明顯，小心棄去上清，步驟7離心后沉淀可見。
▲為減少雜質殘留，此步驟盡可能將上清棄干凈，勿丟失沉淀。
6.加入1 ml 75%乙醇。輕彈管底，讓沉淀懸浮起來，并上下顛倒數次。
7. 8，000 g室溫離心3 min，棄去上清，勿丟失沉淀。
8.重復步驟6和7一遍，棄盡上清。
▲為減少雜質殘留，應盡可能的將上清液棄干凈。建議棄去大部分上清后，短暫離心將所有液體甩至管底，再用移液器將剩余液體吸掉，注意不要吸到沉淀。
9.室溫放置晾干，加入20- 100μL RNase-free ddH2O溶解沉淀，室溫渦旋3 min(或使用移液器反復吹打)，使RNA沉淀充分溶解。提取的RNA產物可以分裝后在-85 ~ -65°C長期保存，在-30 ~-15°C短期保存。
▲通常，RNA沉淀晾干2 - 3 min即可，不要過度晾干，RNA完全干燥后會很難溶解。
▲RNA產物需要充分溶解，否則可能導致濃度定量失準。
使用超微量紫外分光光度計，測量提取RNA樣品的A230、A260、A280，用來計算RNA樣品的濃度、估計RNA純度。
計算溶液中RNA濃度的公式：NA樣品濃度（μg/mL）= A260×40×稀釋倍數
A260不能區分RNA和DNA，因此，建議用無RNase的DNase處理RNA樣品去除DNA污染。 此外，污染物如苯酚和蛋白質會影A260的讀數； 苯酚在波長為260nm處有強烈的吸收，而芳香族氨基酸的吸收在280nm處。 在260nm處吸光度相對于280nm的吸光度比值( A260/A280)可以用來評估RNA樣品中蛋白質的污染水平。純的RNA的A260/A=值接近2.0。
如果有明顯的蛋白質或酚污染，A260/A280 比小于2.0，用紫外分光光度法將不可能準確定量核酸含量。 另一個比值A260/A230可用于評估有機化合物或高離液鹽( chaotropic salt)的污染水平，它們在波長230nm處有強烈吸收，導致低A260/A230。 理想情況下，提取RNA的A260/A230的比例應接近2.0。
▲A260/A280 比值依賴于pH和離子強度。隨著pH的增加，A280 降低， 但A260 不受影響，從而A260/A280的比值增加。因為純水pH為酸性，如果使用它們溶解RNA， A260/A280的比值可能偏低。因此為了準確的可重復的讀數，最好使用緩沖液如TE (pH 8.0)作為稀釋劑和空白對照。
瓊脂糖凝膠電泳分析：
提取的RNA質量優劣可以通過簡單的非變性瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，使用MOPS或TBE緩沖液、配制0.8%瓊脂糖凝膠，在4~5V/cm電壓下進行電泳，若RNA純度較好將會有清晰的三（四）條帶（28S、18S、5.8/5S）且亮度均一（上樣質量一樣）。
常見問題&解決方案
| 常見問題 | 原因 | 解決方案 |
| RNA產物溶解不完全 | 1.干燥時間過長 | 75%乙醇清洗后控制干燥時間，避免過分干燥；延長溶解時間或55~60℃水浴加熱2~3 min |
| 2.產物量過多 | 增加ddH2O投人量，延長溶解時間或55~60℃水浴加熱2~3min | |
| 3.雜質過多 | 樣本充分裂解后，離心取上清后再進行后續操作 | |
| RNA降解 | 1.存在RNase污染 | 確保所有離心管、槍頭及相關溶液都必須無RNase污染；做好防護工作，戴口罩和一次性干凈手套，并在單獨的潔凈區操作 |
| 2.樣本保存不當或 樣本保存時間過久 |
采用新鮮樣本或經液氮速凍后保存于-85~-65°C的樣本 | |
| 3.樣本反復凍融 | 樣本保存時，建議分裝后保存，避免因反復凍融導致的降解；從液氮中取出的樣本應迅速加入裂解液并充分混合均勻，防止樣本因置于室溫時間過長或與裂解液混合不均勻導致RNA降解 | |
| 4.電泳原因 | 電泳前將電泳槽用3%雙氧水浸泡20min，或使用RNA酶和核酸清除劑處理5min，然后用RNase-free ddH2O進行沖洗；電泳緩沖液用RNase-free ddH2O配制；更換新的Loading Buffer | |
| 抑制下游或純度低 | 1.蛋白質污染 | 減少樣本起始投入量；增加單相裂解試劑體積 |
| 2.多糖污染 | 減少樣本起始投入量；增加樣本處理A3步驟 | |
| 3.脂肪污染 | 減少樣本起始投人量；增加樣本處理A3步驟 | |
| 4.鹽殘留 | 增加75%乙醇漂洗次數 | |
| 基因組DNA污染 | 1.不小心吸取到中 間層(TRIzol法) |
離心結束減少晃動，減少吸取上清量 |
| 2.樣本投入量過高 | 減少樣本起始投入量 | |
| 增加單相裂解試劑體積 | ||
| 樣本裂解時，加適量HAc | ||
| 逆轉錄時選擇含有基因組去除模塊的逆轉錄試劑 | ||
| 設計引物時選用跨內含子的引物，從而避免基因組DNA模板參與擴增反應 | ||
| 加入異丙醇離心后看不見沉淀 | 1.樣本投入量低或 RNA含量低 |
加入異丙醇后在2~8℃或-30~-15C放置10-30min后再離心；加入1μL糖原(20mg/mL)進行共沉淀 |
| 2.沉淀丟失 | 進行棄上清操作時，采用吸取而不是傾倒的方法，勿丟失 沉淀 |
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| 3.樣本自身代謝產物多 | 沉淀會分散在離心管壁上，棄上清時沿液面緩慢吸取 |
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